小分子肽标记用于研究细胞膜EpCAM蛋白的成像分析 二

为了排除肽的非特异性标记导致观察到更多的EpCAM簇的可能性，我们将PSmOrange融合到EpCAM中，并在HEK293T细胞中表达该结构，HEK293T细胞是EpCAM不表达细胞。对融合PSmOrange-EpCAM的HEK293T细胞同时进行多肽标记后进行双色成像，并采用基于坐标的共定位（CBC）方法分析共定位（如图）。从统计结果来看，CBC分布趋于1，表明多肽具有良好的识别特异性。
简单地说，dSTORM实现了EpCAM在细胞膜上超分辨成像。重构的图像和统计数据表明，多肽具有较强的识别EpCAM蛋白和区分不同簇的能力。这可以从两个方面来解释。一方面，与抗体（直径10-15 nm）相比，肽具有小尺寸（直径2-5 nm），导致较小的空间位阻，使细胞表面蛋白更容易识别。另一方面，大多数抗体有多个结合位点，在一定程度上可以诱导膜蛋白的交联，而肽只有一个结合位点，肽与靶蛋白的结合比例为1:1，因此，肽分子可作为一种替代抗体的理想探针应用于超分辨率成像。
 
如图， 多肽标记特异性检验。用pcDNA3.1-PSmOrange-EpCAM转染HEK293T细胞，同时用Cy3连接的肽标记。微球校正x-y漂移和红绿通道之间的光学配准。原始图像中标尺为5 µm，在放大图像中标尺为1 µm（i，ii）。用CBC分析了共定位参数。