联用仪器AFM和dSTORM性能测试 二

考察三维超分辨荧光和形貌的联用效果，继续使用已知结构样品F-actin（纤维状结构）为测试样品，进行联用成像。图A和C显示了一组F-actin的联用AFM形貌图和dSTORM原始重构图。从形貌图中观察到具有不同高度、宽度的纤维状和颗粒状凸起物，根据文献中报道的肌动蛋白结构，推测这些纤维状和颗粒状凸起物分别为聚合F-actin和游离G-actin，且推测凸起物具有不同的高度及宽度是由于肌动蛋白的聚集程度不同引起的。dSTORM图显示了特异性标记蛋白F-actin的分布。为确认联用仪器是否也能够提供高分辨率的联用AFM和dSTORM图像，需要对F-actin的联用图像进行分析；在AFM图像中，选择宽度细小的F-actin及G-actin（如图A中的白色及蓝色箭头），获取高度分布，并通过高斯拟合测定高度及半峰全宽；在dSTORM图像中，选择区域进行放大，便于清晰观察F-actin的分布，并在放大区域内选择宽度细小的F-actin（如图19C中的白色线条）进行分析，获取对应荧光强度分布，经高斯拟合测定F-actin的半峰全宽。如图B和D所示，形貌图中选择的F-actin和G-actin的高度分别为10和7 nm，宽度分别为30和16 nm；dSTORM图中选择的F-actin的宽度为20 ~ 30 nm。与上述AFM、dSTORM独立成像结果对比，证实联用仪器在进行联用成像时也可获得高分辨成像。
为了将具体蛋白F-actin的分布精确定位到对应的三维形貌图中，需将形貌图中肌动蛋白的结构与基底区分。如图A所示，通过设置阈值（基底的高度）可区分基底和肌动蛋白结构。为方便后续图像匹配优化，将小于等于阈值的高度值定义为0，即h = 0代表基底；将大于阈值的高度值减去阈值，即h值代表肌动蛋白的高度，且h > 0代表肌动蛋白的结构。将提取的肌动蛋白三维结构与具体蛋白F-actin的分布导入MATLAB配准程序中，并根据AFM和dSTORM图中F-actin的结构，优化仿射变换参数以实现精确定位。如图E所示，左侧图像为AFM形貌图，通过阈值扣除法将F-actin结构（红色区域）与基底（黑色区域）分割出来；中间图像为经仿射变换后的dSTORM图像，展示了特异性标记蛋白F-actin的空间分布；右侧图像为AFM形貌图和经仿射变换后的dSTORM图像间的叠加图，显示出具体蛋白F-actin在形貌图中的定位分布情况，表明利用dSTORM成像得到的特异性标记蛋白F-actin的分布与AFM形貌图中的纤维状结构重叠，证明AFM-dSTORM联用显微镜能够将特定蛋白分子精确定位到AFM形貌图中。

如图. 聚合纤维状肌动蛋白（F-actin）的联用图像。（A）F-actin的形貌图。经扣除基底的高度（15 nm），提取肌动蛋白的结构。标尺为500 nm。（B）对应于图A中箭头所指处聚合（白色箭头）及游离（蓝色箭头）肌动蛋白的高度图。（C）F-actin的dSTORM原始重构图。标尺为500 nm。蓝框中的图为放大图，标尺为100 nm。（D）对应于图C放大图中白线处F-actin的荧光强度分布图。（E）AFM形貌图和dSTORM重构图间的匹配。标尺为500 nm。（F）直方图显示了出现在基底及F-actin处的dSTORM定位点密度。